استخراج اسید نوکلئیک با ستون، مگنتیک یا دستگاه اتوماتیک

اگر شما هم مدیر یک آزمایشگاه تشخیصی یا تحقیقاتی هستید، حتماً این سؤال برایتان پیش آمده که برای استخراج اسید نوکلئیک، کدام روش بهتر جواب می‌ دهد؟ استخراج ستونی، استخراج مگنتیک یا دستگاه استخراج اتوماتیک؟ انتخاب اشتباه در این مرحله می‌ تواند نتیجه کل آزمون Real-Time PCR یا NGS شما را زیر سؤال ببرد. در این مقاله، سه روش اصلی را با هم مقایسه می‌ کنیم و نام دستگاه‌ های واقعی هر روش را مشخص می‌ کنیم تا بتوانید بر اساس نیاز واقعی آزمایشگاهتان تصمیم بگیرید.

استخراج اسید نوکلئیک ستونی چیست و برای چه آزمایشگاه‌ هایی مناسب است؟

استخراج ستونی یا Column-Based Extraction، آشناترین روش برای هر کارشناس آزمایشگاهی است. در این روش، اسید نوکلئیک در حضور نمک‌ های chaotropic به غشای سیلیکا داخل ستون می‌چسبد، سپس با چند مرحله شستشو و در نهایت الوشن با بافر کم‌ نمک جدا می‌ شود .

مزیت اصلی این روش، خلوص بالای محصول نهایی است. نسبت جذب A260/A280 معمولاً بین ۱.۶ تا ۱.۸ گزارش می‌شود . اگر کار شما تعیین توالی یا NGS است، ستون‌ ها هنوز هم انتخاب مطمئنی هستند.

کیت‌ ها و دستگاه‌ های رایج استخراج ستونی:

- کیت RNA/DNA استخراج ستونی DaanGene (مدل DA0590 و DA0591): برای نمونه‌ های سرم، پلاسما، سواب حلق و بینی طراحی شده و با سانتریفیوژ 12000 دور کار می‌کند.
- کیت PSP® Spin Stool DNA (شرکت Stratec): مخصوص نمونه‌ های مدفوع با پروتکل اختصاصی برای حذف مهارکننده‌ های PCR.

- محدودیت اصلی: فرآیند نیمه‌ خودکار است و هر بچ معمولاً 15 تا 30 دقیقه زمان می‌ برد . برای حجم بالای نمونه، خستگی اپراتور می‌ تواند بر تکرارپذیری اثر بگذارد.

استخراج مگنتیک: سرعت بالا با ذرات مغناطیسی

استخراج مگنتیک یا Magnetic Bead-Based Extraction، رویکردی متفاوت ارائه می‌ دهد. ذرات مغناطیسی پوشش‌ داده‌ شده با سیلیکا، اسید نوکلئیک را متصل می‌ کنند. سپس با اعمال میدان مغناطیسی، ذرات از محلول جدا شده و شستشو انجام می‌ شود.

بزرگ‌ ترین مزیت مگنتیک، حذف نیاز به سانتریفیوژ است. همین ویژگی آن را برای اتوماسیون ایده‌ آل می‌کند.

کیت‌ ها و دستگاه‌ های رایج استخراج مگنتیک:

- کیت exsig® Mag (شرکت Primer design): شامل بافر لیز، بافر اتصال، سوسپانسیون ذرات مغناطیسی و سه بافر شستشو برای DNA و RNA کاربرد دارد.
- دستگاه Kingfisher Duo Prime (Thermo Fisher): سیستم نیمه‌ خودکار با فناوری MagMAX که با کیت‌ های MagMAX DNA Multi-Sample Ultra 2.0 و MagMAX mirVana Total RNA کار می‌کند.
- دستگاه Clean Xtract 96 (CleanNa): پردازش 1 تا 96 نمونه با حجم 50 تا 1000 میکرولیتر، مجهز به لامپ UV و صفحه لمسی 10 اینچ.

نقطه ضعف: بازدهی مگنتیک کمی پایین‌تر از ستون‌های سیلیکا است و کالیبراسیون ماژول مغناطیسی اهمیت دارد.

دستگاه استخراج اتوماتیک: آیا سرمایه‌ گذاری روی آن منطقی است؟

دستگاه استخراج اتوماتیک یک روش جداگانه نیست، بلکه پلتفرمی است که می‌ تواند بر پایه ستون یا مگنتیک کار کند. ربات‌ های آزمایشگاهی تمام مراحل را بدون دخالت انسان انجام می‌ دهند.

دستگاه‌ های اتوماتیک معروف و روش پایه آن‌ ها:

- Stream SP96 (شرکت DaanGene): بر پایه مگنتیک، با صفحه 96 چاهک و کیت‌ های پیش‌ پر از قبل. برای حجم بالا با حداقل دخالت اپراتور طراحی شده.
- Smart32 Plus (شرکت DaanGene): بر پایه مگنتیک، پردازش دو صفحه 96 چاهک به‌ طور همزمان.
- KingFisher Apex / KingFisher Flex (Thermo Fisher): بر پایه مگنتیک، با فناوری KingFisher و کیت‌ های MagMAX. مناسب برای استخراج cfDNA از پلاسما و نمونه‌ های بالینی.
- Maxwell RSC 16 (Promega): بر پایه مگنتیک، پردازش 16 نمونه به‌ طور همزمان. در مطالعه‌ ای بر روی نمونه‌ های مدفوع، بازدهی قابل‌ قبولی نشان داد.
- QIAcube (Qiagen): بر پایه ستونی با اتوماسیون. در مقایسه‌ ای بر روی نمونه‌ های ویروسی، بالاترین بازیابی DNA ویروسی را در پلاسما و سرم داشت.
- EZ1 Advanced (Qiagen): بر پایه مگنتیک، ظرفیت 1 تا 14 نمونه. در همان مطالعه، عملکرد آن بسته به نوع نمونه متفاوت بود.

مزیت اصلی اتوماسیون، حذف خطای انسانی و افزایش تکرارپذیری بین‌ روزی است. هزینه اولیه بالا بزرگ‌ ترین مانع است.

کدام روش را برای آزمایشگاه خود انتخاب کنیم؟

اگر خلوص DNA برای NGS حیاتی است و حجم نمونه متوسط است، ستون‌ ها انتخاب مطمئنی هستند. اگر سرعت و پردازش انبوه اولویت دارد، مگنتیک یا اتوماتیک گزینه بهتری است. اگر بودجه اولیه کافی دارید و می‌ خواهید خطای انسانی را به حداقل برسانید، سرمایه‌ گذاری در اتوماسیون در بلندمدت بازدهی دارد.

موفقیت در استخراج اسید نوکلئیک تنها به انتخاب روش بستگی ندارد. کیفیت نمونه اولیه و بروتوکل استاندارد به همان اندازه مهم هستند.

پرسش‌ های متداول درباره استخراج اسید نوکلئیک

1- آیا استخراج مگنتیک برای نمونه‌ های بافتی هم مناسب است؟

بله، اما برای بافت‌ های سخت مانند بافت فیبروز، ممکن است نیاز به لیز اضافی یا هموژنایزر داشته باشید. مطالعه‌ ای نشان داد که برای نمونه‌ های مدفوع، ترکیب Bead-Beating با دستگاه مگنتیک Maxwell بازدهی را به‌ طور معناداری افزایش می‌ دهد.

2- آیا دستگاه استخراج اتوماتیک برای آزمایشگاه‌ های کوچک هم به‌ صرفه است؟

معمولاً نه. اگر روزانه کمتر از 50 نمونه دارید، استخراج ستونی یا مگنتیک دستی اقتصادی‌ تر است. هزینه هر نمونه در سیستم‌ های اتوماتیک به‌ طور قابل‌ توجهی بیشتر از روش دستی است.

3- کدام روش برای استخراج RNA بهتر است؟

برای RNA، ستون‌های سیلیکا با DNase I روی ستون، خلوص بالاتری می‌ دهند. اما مگنتیک هم با کیت‌ های مخصوص RNA مانند MagMAX mirVana نتایج خوبی دارد. در مطالعه‌ ای، RNA استخراج‌ شده با این کیت بدون آلودگی gDNA بود، در حالی که ستون برخی برندها آلودگی نشان داد.

جمع‌ بندی: انتخاب درست، نتیجه درست

انتخاب بین استخراج ستونی، مگنتیک و اتوماتیک یک معاوضه است: خلوص در مقابل سرعت، و هزینه اولیه در مقابل بهره‌ وری بلند مدت. با درک دقیق نیازهای آزمایشگاه و حجم نمونه‌ های ورودی، و توجه به نام دستگاه‌ ها و روش پایه آن‌ ها، می‌ توانید تصمیمی بگیرید که هم کیفیت نتایج را تضمین کند و هم از نظر عملیاتی پایدار باشد.

مبناژن: راهنمای شما جهت تهیه انواع کیت و دستگاه های استخراج اسید نوکلئیک.