معرفی انواع پی سی آر و تفاوت آن ها با یکدیگر - بخش اول

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز روشی است که جهت تکثیر کنترل شده یک توالی نوکلئوتیدی شناخته شده و معین در محیط آزمایشگاهی (in-vitro) استفاده می گردد. این تکنیک شامل انواع مختلفی بوده که در این مقاله و مقاله های بعدی قصد داریم تمامی روش ها و انواع آن را که در حال حاضر در سراسر دنیا و بسته به شرایط مختلف استفاده می شود معرفی نماییم.

دسته بندی انواع روش های PCR

1 - شاخه های PCR استاندارد (Conventional PCR)
2 - پی سی آر در زمان واقعی (qPCR) (Real-Time PCR or Quantitative PCR)
3 - ترکیب qPCR / RT-PCR

تغییر در روش پایه ای PCR منجر به پیشرفت و ایجاد انواع PCR شد که در زیر توصیف شده اند:

- پی سی آر ویژه آلل (Allele specific PCR (Tetra-primer ARMS PCR))

PCR ویژه آلل روشی است که به کمک آن می توان جهش نقطه ای در DNA را به صورت مستقیم شناسایی نمود. در این روش داشتن شناخت نسبت به توالی DNA هدف مانند تفاوت میان آلل ها ضروری بوده و نوعی پرایمر دارای انتهای 3’ ناجور که حاوی تغییرات تک نوکلئوتیدی است نیاز دارد. برای هر آلل SNP یک پرایمر ویژه طراحی شده که مکمل چندشکلی تک نوکلئوتیدی انتهای 3’ توالی مورد نظر می باشد. در هر صورت جهت شناسایی دو آلل از یک SNP دو واکنش پی سی آر مورد نیاز است.

- پی سی آر نامتقارن (Asymmetric PCR)

این روش نوعی از PCR است که در آن یک پرایمر غلظت بیشتری نسبت به پرایمر دیگر دارد؛ به صورتیکه تکثیر توالی هدف به صورت عامدانه و بر پایه ریاضیات به کمک پرایمر اضافه انجام می شود.

- پی سی آر کلونی (Colony PCR)

از این روش به صورت معمول جهت مطالعه ژنوم باکتری ها استفاده می گردد. توسط این تکنیک کلونی های باکتریایی حاصل از القا پلاسمید با تکثیر بالا به آن ها غربالگری می گردند. این روش علاوه بر فراهم کردن میزان کافی از محصول PCR جهت توالی یابی به عنوان جایگزین روش غربالگری سنتی کلونی آبی و سفید استفاده می شود.

- پی سی آر دژنره (Degenerate PCR)

یکی از انواع روش های PCR است که از پرایمرهای دژنره به منظور تکثیر توالی های ناشناس پیوسته به توالی های شناخته شده استفاده می نماید. این پرایمرها بر اساس همولوژی ژن شناسایی و توالی سنجی شده طراحی شده اند. از این روش در شناسایی ژن های اورتولوگ از ارگانیسم های مختلف یا عضوی جدید از یک خانواده ژنی استفاده می گردد.

- پی سی آر هات استارت (Hotstart PCR)

تنها تفاوتی که این روش با PCR معمولی دارد اضافه شدن پلیمراز Taq به مخلوط واکنش در زمانی است که بقیه اجزای واکنش فوق تا دمای ذوب DNA گرما داده شده اند بدین ترتیب از تولید محصولات غیراختصاصی ممانعت می کند. در بعضی مواقع هم می توان از پلیمراز Taq متصل به مهارکننده هایی استفاده نمود که پس از رسیدن مخلوط واکنش به دمای ذوب Tm مهارکننده ها از آن جدا شده و آنزیم فعال می گردد.

- پی سی آر معکوس (Inverse PCR)

برخلاف PCR معمولی که برای تکثیر توالی نوکلئوتیدی نیاز به سر 3’ آزاد 2 پرایمر رفت و برگشت دارد در این روش DNA از یک قطعه که توالی آن شناخته شده است تکثیر می شود. قطعه تکثیر شده یک DNA حلقوی است که از برش و اتصال محدود کننده در توالی مورد نظر به دست می آید و از آن می توان جهت اتصال پرایمر برای انجام عمل PCR استفاده نمود.

- پی سی آر مینی پرایمر (Miniprimer PCR)

از این تکنیک PCR در مواردی مانند شناسایی ژنوتیپ محافظت شده سلول پروکاریوتی (16S rRNA) و یوکاریوتی (18S rRNA) جهت مطالعات تکاملی و رده بندی آن ها مورد استفاده قرار می گیرد. در این روش از یک پرایمر با توالی کوتاه 10 نوکلئوتیدی و پلیمراز Taq مهندسی شده استفاده می گردد که در حالتی که طول پرایمر 20-30 نوکلئوتید باشد تکثیر توالی محافظت شده میسر نیست.

- پی سی آر چندگانه (Multiplex PCR)

از این روش در موارد مختلفی نظیر شناسایی و بررسی سریع حذف های ژنی، مضاعف شدگی ها، جهش ها و چندشکلی ها، ریز ماهواره ها و چندشکلی های تک نوکلئوتیدی (SNP) در ژن های بزرگ استفاده می گردد. در این روش در یک واکنش PCR از پرایمرهای مختلف برای تکثیر آمپلیکون در اندازه های مختلف و اختصاصی استفاده می شود؛ به گونه ای که چندین ژن مورد بررسی قرار می گیرد. همچنین آمپلیکون ها باید به اندازه کافی تفاوت اندازه داشته تا در ژل به راحتی قابل تفکیک و تشخیص باشد.

- پی سی آر آشیانه (Nested)

در این روش PCR از دو مرتبه PCR کاملاً مجزا جهت تکثیر توالی DNA استفاده می شود. به گونه ای که در یک مرحله از یک مجموعه پرایمر و در مرحله دوم از یک مجموعه پرایمر دیگر استفاده می گردد. در واقع هدف از این روش به حداقل رساندن تکثیر محصولات غیراختصاصی بوده و توالی مورد نظر دارای دو جایگاه هدف می باشد؛ به طوری که امکان وجود دو جایگاه اختصاصی در توالی ناخواسته نزدیک به صفر بوده و نتیجه نهایی یک محصول PCR بسیار خالص خواهد بود.

- پی سی آر تاچ داون (Touchdown)

از این تکنیک نیز در جهت کاهش حداکثری توالی های غیراختصاصی استفاده می گردد. در این روش پرایمرها در مراحل ابتدایی در حداکثر دمای ممکن به توالی هدف شان متصل می شوند. سپس دمای اتصال در مراحل بعدی به صورت تدریجی کاهش یافته که این روند امکان تکثیر انحصاری توالی اختصاصی مورد نظر را به ما می دهد. دمایی که حداقل مجاز جهت اتصال غیراختصاصی پرایمر به توالی هدف می باشد.

- پی سی آر رونویسی معکوس Reverse Transcription-PCR (RT- PCR)

هدف این روش که یک روش کمی می باشد تولید DNA دو رشته ای از مولکول تک رشته ای RNA است که در ابتدا آنزیم رونوشت بردار معکوس cDNA که مکمل RNA می باشد را تولید نموده و در ادامه cDNA تولید شده توسط روش PCR معمولی تکثیر می گردد.