معرفی انواع پی سی آر و تفاوت آن ها با یکدیگر - بخش دوم

در مقاله بخش اول که معرفی انواع روش های پی سی آر بود به تشریح تعدادی از روش های PCR کیفی (Conventional) پرداختیم

در این مقاله نیز به تشریح تعداد دیگری از این روش ها می پردازیم

اگر مقاله پیشین را خوانده باشید در آنجا گفتیم که روش های PCR به طور کلی به صورت زیر دسته بندی می گردند:

دسته بندی انواع روش های  PCR

1 - شاخه های PCR استاندارد  (Conventional PCR)
2 - پی سی آر در زمان واقعی  (qPCR) (Real-Time PCR or Quantitative PCR)
3 - ترکیب  qPCR / RT-PCR

 تغییر در روش پایه ای PCR منجر به پیشرفت و ایجاد انواع PCR شد که در زیر توصیف شده اند: (ادامه توصیف روش ها)

 
- AFLP PCR

این روش PCR از لحاظ میزان تکثیر، حساسیت و وضوح نسبت به روش های مشابه یعنی RAPD (DNA چندشکلی تکثیرشده تصادفی) و RFLP (پلی مورفسیم طول قطعه محدود) برتری داشته و دارای کاربردهایی نظیر تشخیص تنوع ژنتیکی در گونه ها یا سویه های نزدیک باکتری ها، گیاهان، قارچ ها و حیوانات می باشد. همچنین از این روش در پزشکی قانونی مانند تشخیص هویت، تولید نقشه های ژنتیکی جهت تجزیه و تحلیل مکان کمی صفت (QTL) و تعیین تفاوت های جزئی در جمعیت ها استفاده می شود. نحوه انجام آن مبتنی بر اتصال آداپتورهای مختلف به نقاط هضم کامل DNA هدف توسط آنزیم های محدود کننده بوده و پرایمرهای اختصاصی این آداپتورها به آنها متصل می شوند که در صورت تکثیر و مشاهده باندهای آن ها بر روی ژل الکتروفورز به این معنی است که توالی مورد نظر در DNA هدف موجود بوده است. از مزایای دیگر این روش تکثیر 50 تا 100 قطعه مجزا به صورت همزمان می باشد.

- Alu PCR

این تکنیک یکی از روش های مؤثر در تشخیص بیماری های وراثتی و جهش های ژنتیکی مرتبط با سرطان است. همچنین از این روش در انگشت نگاری ژنتیکی برای مشخص کردن چندشکلی ژنتیکی در انسان و پستانداران و تمییز سلول های انسانی از سایر سلول های حیوانی استفاده می شود. اساس این روش بر پایه توالی های Alu موجود در ژنوم بوده که تعداد این توالی ها که حدود 300 نوکئوتید طول دارند در ژنوم انسان به بیش از یک میلیون نسخه می رسد. این عناصر نوعی نشانگر ژنتیکی قابل انتقال بوده که در کل ژنوم یافت شده و در تکامل نقش دارند. این توالی ها اختصاصیت گونه ای داشته و برای شناسایی آن ها در qPCR از یک جفت پرایمر که دارای برچسب فلوروکروم هستند استفاده می شود.

- Assembly PCR

این روش در واقع یک روش زیرکانه جهت حذف مرحله برش و اتصال وکتور و DNA ژن هدف که مرحله ای اساسی در کلونینگ ژن می باشد بوده و تمام این مراحل در دو واکنش PCR مجزا اتفاق می افتد. در واکنش اول هر دو DNA به صورت انبوه و با پرایمرهای اختصاصی هر کدام تکثیر شده و در واکنش PCR دوم دو DNA فوق به کمک جفت پرایمرهایی که در طول 20 نوکلئوتید با یکدیگر همپوشانی دارند به یکدیگر متصل (فیوژ) و منجر به محصول کامل (فیوژن ژن) می شوند.

- ISSR PCR

ISSRها قطعات DNA با طول حدود 100 تا 3000 جفت باز هستند که بین نواحی میکروستلایت (ریز ماهواره) مجاور که جهت گیری مخالف به هم را دارند قرار گرفته اند. نحوه تکثیر این قطعات توسط روش PCR با استفاده از توالی های هسته میکروستلایت به عنوان پرایمر به همراه تعداد کمی نوکلئوتید انتخابی به عنوان لنگر که به داخل نواحی مجاور غیرتکراری راه دارند (16 تا 18 جفت باز) می باشد. حدود 10 تا 60 قطعه از جایگاه های متعدد که به صورت همزمان تکثیر می شوند توسط تکنیک ژل الکتروفورز جداسازی شده و تحت عنوان حضور و غیاب قطعات با اندازه های معین امتیازبندی می گردند. تکنیک های مرتبط با تجزیه و تحلیل ISSR شامل 1- واکنش تکثیر تک پرایمری (SPAR) که از یک تک پرایمر شامل تنها موتیف هسته یک میکروستلایت و 2- تکثیر هدایت شده DNA با ناحیه مینی ستلایت (DAMD) که از یک تک پرایمر شامل تنها موتیف هسته یک مینی ستلایت استفاده می کنند می باشد. به دلیل مشخصات انگشت نگاری چندجایگاهی که به دست می آید، تجزیه و تحلیل ISSR می تواند در مطالعاتی مانند هویت ژنتیکی، تعیین والد، شناسایی سویه های نژادی و کلون ها و مطالعات طبقه بندی گونه های خیلی نزدیک به هم به کار گرفته شود. به علاوه، ISSRها در مطالعات نقشه برداری ژنتیکی مفید دانسته می شوند.

- LATE PCR

در PCR نامتقارن معمولی به دلیل محدود بودن غلظت یک پرایمر به ناچار دمای ذوب پرایمرها پایین تر از دمای اتصال آن ها می باشد و بدین ترتیب این نوع از PCR سخت و ناکارآمد است. تکنیک PCR خطی پس از لگاریتمی (LATE-PCR) یک الگوی جدید برای طراحی پرایمر را ارائه داده که بدون توجه به نسبت غلظت پرایمرها، خروجی آن آزمون هایی به کارآمدی آزمون های PCR متقارن است. روش LATE-PCR محصولات تک رشته ای با سینتیک قابل پیش بینی در محدوده ای فراتر از فاز لگاریتمی برای تعداد بسیاری از چرخه ها را ایجاد می نماید. این روش معیارهای طراحی پروب جدیدی را ارائه داده که تشخیص پروب هیبریداسیون را از اتصال و طویل سازی پرایمر جدا می نماید و بدین ترتیب موجب افزایش قابلیت اطمینان به پروب، بهبود تمییز میان آلل ها و افزایش قدرت سیگنال دهی 80 تا 250 درصد نسبت به PCR متقارن می گردد. این بهبودها در PCR به طور ویژه ای در تجزیه و تحلیل کمی زمان واقعی (ریل تایم) مقادیر عددی هدف در نمونه های کوچک مفید می باشد. روش LATE-PCR با کاربردهای با بازدهی بالا در زمینه هایی مانند تشخیص های بالینی، پزشکی قانونی، دفاع زیستی و توالی یابی DNA سازگار می باشد.

- Long Range PCR

این روش در واقع جهت تکثیر DNA با طول زیادتر از حد معمول (بیش از 35 کیلوباز) در سال 1994 ابداع شد. بدین ترتیب که از دو آنزیم پلیمراز که یکی از آن ها DNA Taq polymerase (جهت طویل سازی سریع) و دیگری پلیمراز دارای فعالیت تصحیح (جهت دقت) می باشد استفاده می گردد. در حالت عادی خطاهای تکثیر توالی هدف اجازه سنتز آن با طول بالا را نمی دهد ولی در روش Long Range PCR در کنار استفاده از آنزیم های مناسب با بهینه سازی شرایط واکنش PCR می توان رشته هایی با طول بسیار بالاتر از واکنش PCR مرسوم سنتز نمود. از شرایطی که می توان واکنش Long Range PCR را با آن بهینه نمود می توان به افزایش pH بافر (جهت فعالیت بهتر پلیمراز دارای خاصیت اگزونوکلئازی) ، استفاده از بازه دمایی مناسب کارایی آنزیم، تغییر حرارتی هرچه سریع تر چرخه واکنش، زمان کافی برای تکثیر قطعات با طول بالا و داشتن DNA ژنومی با کیفیت بالا اشاره نمود.

- Methylation-specific PCR

پی سی آر ویژه متیلاسیون (MSP) روشی است که می تواند مستقل از آنزیم های محدود کننده حساس به متیلاسیون عملاً هر گروهی از نواحی CpG را به سرعت در یک جزیره CpG ارزیابی نماید. این آزمون مستلزم اصلاح اولیه DNA توسط سدیم بی سولفیت بوده که به دنبال تکثیر متعاقب با پرایمرهایی که مختص DNA متیله در برابر DNA غیرمتیله بوده، تمام سیتوزین های غیرمتیله را به اوراسیل تبدیل کرده ولی سیتوزین های متیله را دست نخورده باقی بگذارد. حساسیت بالای این تکنیک اجازه می دهد تا نه تنها DNA به دست آمده از بافت های یخ زده تازه، خون محیطی، مغز استخوان یا مایعات بدن، بلکه از نمونه های بلوکه شده با پارافین مورد تجزیه و تحلیل متیلاسیون کیفی قرار گیرد. این تکنیک یک روش سریع و مقرون به صرفه بوده که به معرف های رادیواکتیو نیاز نداشته و می تواند جهت آنالیز تعداد زیادی از نمونه های بالینی مورد استفاده قرار بگیرد.

- rep-PCR

استفاده از پرایمرهای معین برای تکثیر عناصر تکراری پراکنده در DNA حاضر در مکان های متمایز در ژنوم های پروکاریوتی با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، واکنش زنجیره ای پلیمراز بر پایه توالی عناصر تکراری (rep-PCR) نامیده می شود. کشف اولیه عناصر تکراری خارج ژنی پالیندرومیک (REP) در ژنوم های اشریشیا کلی و سالمونلا به وقوع پیوست. به طور کلی خانواده عناصر REP بین 33 تا 40 جفت باز طول و 500 تا 1000 نسخه در هر ژنوم داشته و دربرگیرنده حدود 1% ژنوم های باکتریایی اشریشیا کلی یا سالمونلا می باشند. قطعات DNA تکثیرشده زمانی که توسط الکتروفورز جدا می گردند یک اثر انگشت ژنومی را تشکیل داده که می تواند برای تمییز زیرگونه ها و ترسیم سویه های باکتریایی و قارچی به کار گرفته شود. کاربرد rep-PCR به عنوان یک ابزار متمایزکننده و قابل تکرار برای میکروب ها جهت آنالیز زیرگونه های آن ها و تحقیقات بوم شناسی میکروبی به اثبات رسیده است.

- Core sample PCR

از این روش PCR جهت تکثیر مجدد محصولات PCR معین از مخلوطی از محصولات PCR در واکنش اولیه استفاده می گردد. استفاده از این تکنیک در واکنش های PCR دی ان ای ژنومی یوکاریوتی و در واکنش هایی که از پرایمرهای اولیگونوکلئوتید دژنره استفاده می کنند مفید می باشد؛ زیرا محصول هر دوی این واکنش ها نه یک محصول PCR مجزا که اغلب یک اسمیر از محصولات PCR در محدوده اندازه صحیح می باشد.

- Dial-out PCR

در این تکنیک که در سال 2012 توسط جرود شوارتز و همکارانش ارائه شد برچسب های تصادفی به الیگونوکلئوتیدها اضافه شده و جهت شناسایی از توالی یابی با بازدهی بالا و سپس جهت جداسازی مولکول های با توالی کامل از روش PCR استفاده می گردد. این تکنیک در واقع راهی برای بازیابی دقیق مولکول های DNA جهت فرآیند سنتز ژن می باشد. به گونه ای که یک کتابخانه پیچیده از مولکول های DNA پیش از توالی یابی موازی عظیم با استفاده از برچسب های حاشیه ای واحد دستکاری می شود. سپس پرایمرهای هدایت شده توسط برچسب ها به کمک روش PCR امکان بازیابی مولکول ها با توالی های مورد نظر را فراهم می نمایند. روش Dial-out PCR همچنین به ما توان غربالگری کلون برون تنی (in vitro) چندگانه را داده و یک جایگزین متقاعدکننده برای کلونینگ درون تنی (in vivo) و روش توالی یابی سنگر جهت سنتز دقیق ژن ها می باشد.

شرکت مبنامد ارائه دهنده بهترین دستگاه های PCR و Real-Time PCR روز دنیا مفتخر است تا همانند سابق بتواند در راه خدمات رسانی به جامعه پزشکی و آزمایشگاهی کشور و ارتقاء سلامت جامعه گام بردارد.