کریسپر کس 9 RISPR/Cas

سیستم CRISPR/Cas یک فناوری قدرتمند است که به‌عنوان ابزار ویرایش ژنی برای اصلاح انتخابی توالی‌های DNA در هر مکان خاص در ژنوم با دقت بسیار بیشتری نسبت به فناوری‌های مرسوم اصلاح ژنوم استفاده می‌شود. کشف این سیستم تحولی در توسعه زیست شناسی مولکولی با کاربردهای سودآور در پزشکی و بیوتکنولوژی ایجاد کرده است. در سال‌های اخیر، CRISPR/Cas به دلیل کاربرد بالقوه آن در مهندسی ژنوم و اپی ژنوم هدفمند، برای کشف علم و حقایق پنهان در پس فرآیندهای پیچیده زندگی، یک حوزه تحقیقاتی جذاب بوده است. با شناسایی CRISPR/Cas در باکتری‌ها، کاوش‌های دقیقی برای شناسایی سیستم‌های جدیدتر و کارآمد CRISPR/Cas، برای گسترش دامنه کاربردها در مهندسی ژنتیک و زیست‌شناسی مولکولی انجام شده است. سیستم‌های CRISPR که در 40 درصد باکتری‌ها یافت می‌شوند، بخشی از سیستم‌های ایمنی سازگار در برابر مواد ژنتیکی مهاجم هستند. تا به امروز، سیستم‌های CRISPR-Cas به دو کلاس و شش نوع اصلی طبقه‌ بندی شده‌اند که در میان آنها، سیستم CRISPR/Cas9 توجه زیادی را برای مهندسی ژنوم به خود جلب کرده است. سیستم CRISPR-Cas9 بر اساس فعالیت نوکلئولیتیک پروتئین اندونوکلئاز، Cas9 است که توسط یک RNA تعیین کننده ویژگی، به نام RNA راهنما (gRNA) به محل مورد نظر در ژنوم هدایت می شود. جدای از اینها، توالی دیگری به نام موتیف مجاور پروتوسپیسر (PAM) که در مجاورت سایت هدف قرار دارد، توسط سیستم CRISPR/Cas9 شناسایی شده و برای عملکرد Cas9 بسیار مهم است. پروتئین Cas9 در حضور gRNA با دقت بالا به محل هدف متصل می‌شود و با مکانیسم ترمیم اتصال انتهایی غیرهمولوگ سلول، یک شکست دو رشته‌ای و به دنبال آن جهش‌های ایندل در محل برش ایجاد می‌کند. با استفاده از الگوی تعمیر از پیش طراحی شده، بازهای خاص در DNA را نیز می توان با تعمیر واسطه نوترکیبی همولوگ تغییر داد.

آرایه CRISPR RNA چیست؟

CRISPR-Cas یک سیستم ایمنی سازگار میکروبی است که از نوکلئازهای هدایت شونده با RNA برای جدا کردن عنصر ژنتیکی خارجی استفاده می کند. سه نوع (I-III) از سیستم‌های CRISPR در طیف وسیعی از میزبان‌های باکتریایی و باستانی شناسایی شده‌اند که در آن هر سیستم شامل خوشه‌ای از ژن‌های مرتبط با CRISPR (Cas) ،RNA های غیرکدکننده و آرایه‌ای متمایز از عناصر تکراری (تکرار مستقیم) است. این تکرارها با توالی های متغیر کوتاه مشتق شده از اهداف DNA برون زا که به عنوان پروتوسپیسر شناخته می شوند، فاصله می گیرند و با هم آرایه CRISPR RNA (crRNA) را تشکیل می دهند. در داخل هدف DNA، هر پروتوسپیسر همیشه با یک موتیف مجاور پروتوسپیسر (PAM) همراه است که بسته به سیستم CRISPR خاص می‌تواند متفاوت باشد.

Cas9یک نوکلئاز جهت ویرایش ژنوم

سیستم CRISPR نوع II یکی از بهترین مشخصه هاست که شامل نوکلئاز Cas9، آرایه crRNA که RNA های راهنما را کد می کند و یک crRNA فعال کننده ترانس کمکی (tracrRNA) است که پردازش آرایه crRNA را به واحدهای مجزا تسهیل می کند. سپس هر واحد crRNA حاوی یک توالی راهنما 20 nt و یک تکرار مستقیم جزئی است که در آن واحد اول Cas9 را از طریق جفت شدن باز Watson-Crick به یک هدف DNA 20 جفت باز هدایت می کند. عملکرد نوکلئاز هدایت‌شده با RNA CRISPR-Cas در سلول‌های پستانداران از طریق بیان هترولوگ Cas9 بهینه‌شده با کدون انسانی و اجزای RNA مورد نیاز بازسازی می‌شود. علاوه بر این، crRNA و tracrRNA را می توان برای ایجاد یک RNA کایمریک و تک راهنما (sgRNA)27 با هم ترکیب کرد. بنابراین Cas9 را می توان با تغییر توالی راهنمای 20-nt در sgRNA به سمت تقریباً هر هدف مورد علاقه در مجاورت توالی PAM هدایت کرد.
با توجه به سهولت پیاده سازی و ظرفیت مالتی پلکسی، Cas9 برای تولید سلول های یوکاریوتی مهندسی شده که دارای جهش های خاص از طریق NHEJ و HDR22،23،24،25،40 هستند، استفاده شده است. تزریق مستقیم sgRNA و mRNA که Cas9 را کد می کند به جنین، تولید سریع موش های تراریخته با چندین آلل اصلاح شده را امکان پذیر کرده است. این نتایج برای ویرایش موجوداتی که از نظر ژنتیکی غیرقابل تحمل هستند، نویدبخش است.

شناسایی رشته های هدف توسط  کریسپر کس 9 

نوکلئازهای Cas9 با استفاده از حوزه‌های نوکلئاز حفظ‌شده HNH و RuvC، برش خاص رشته‌ای را انجام می‌دهند، که می‌توانند جهش یافته و برای عملکرد اضافی مورد سوء استفاده قرار گیرند. یک جهش آسپارتات به آلانین (D10A) در حوزه کاتالیزوری RuvC به جهش نیکاز Cas9 (Cas9n) اجازه می دهد تا به جای شکافتن DNA برای ایجاد شکستگی های تک رشته ای، سوراخ کند و تعمیر ترجیحی بعدی از طریق HDR22 به طور بالقوه می تواند فرکانس را کاهش دهد. جهش های ایندل ناخواسته از DSB های خارج از هدف جفت‌های sgRNA به‌طور مناسب می‌توانند Cas9n را هدایت کنند تا به طور همزمان هر دو رشته مکان هدف را برای واسطه‌گری DSB برش دهد، بنابراین به طور موثر ویژگی تشخیص هدف را افزایش می‌دهد. 

عملکرد سیستم کریسپر کس در انسان 

 CRISPR/Cas9  ژن ها را با برش دقیق DNA و سپس اجازه دادن به فرآیندهای طبیعی ترمیم DNA را ویرایش می کند. این سیستم از دو بخش تشکیل شده است: آنزیم Cas9 و یک RNA راهنما. تبدیل سریع یک فناوری انقلابی به درمان های تحول آفرین.
CRISPR-Cas9 از یک رشته کوچک RNA برای هدایت آنزیم Cas9 به محلی در ژنوم با توالی مشابه استفاده می کند. سپس آنزیم هر دو رشته DNA را در آن محل قطع می کند و سیستم های ترمیم سلولی شکاف را بهبود می بخشد.

کریسپر کس و درمان بیماری ها

دانشمندان در حال مطالعه CRISPR برای بسیاری از شرایط، از جمله کلسترول بالا، HIV و بیماری هانتینگتون هستند. محققان همچنین از CRISPR برای درمان دیستروفی عضلانی در موش ها استفاده کرده اند. به احتمال زیاد، اولین بیماری CRISPR که به درمان کمک می‌کند تنها به دلیل یک نقص در یک ژن، مانند بیماری سلول داسی شکل ایجاد می‌شود.

چرا از Cas9 استفاده می شود؟

Cas9 یک اندونوکلئاز هدایت‌شونده با RNA باکتریایی است که از جفت‌سازی باز برای شناسایی و شکاف DNA هدف با مکمل بودن RNA راهنما استفاده می‌کند. ویژگی توالی قابل برنامه ریزی Cas9 برای ویرایش ژنوم و کنترل بیان ژن در بسیاری از ارگانیسم ها به کار گرفته شده است.

وارد کردن ژن ها توسط سیستم  کریسپر کس 9

فرم استاندارد CRISPR شامل افزودن پروتئینی به نام Cas9 به همراه یک قطعه RNA راهنما به سلول است. پروتئین در ژنوم جستجو می کند تا زمانی که DNA را پیدا کند که با توالی RNA راهنما مطابقت دارد و سپس DNA را در این نقطه قطع می کند.
رایج ترین آنزیم مورد استفاده در کریسپر Cas9 می باشد. کمپلکس های معمولی CRISPR شامل آنزیمی به نام Cas9 است که بخش هدفی از DNA را تشخیص داده و قطع می کند. برای ویرایش توالی‌های DNA، آنزیم Cas9 باید یک توالی ژنتیکی کوتاه به نام موتیف پیش‌اسپیسر مجاور (PAM) را شناسایی کند که در DNA هدف جاسازی شده است.

پروتئین Cas9

پروتئین Cas9 یک پروتئین چند دامنه ای است که از دو حوزه نوکلئولیتیک (RuvC و HNH) تشکیل شده است که مسئول شکستن دو رشته DNA هدف است. باقی مانده های کلیدی مسئول فعالیت کاتالیزوری Cas9 به ترتیب D10 و H840 از RuvC و HNH هستند. معرفی جهش نقطه ای، برای جایگزینی هر دو باقیمانده با آلانین، یک پروتئین Cas9 با کمبود نوکلئاز به نام Cas9 یا dCas9 مرده تولید کرد. اگرچه فعالیت نوکلئاز dCas9 از بین می رود، اما پروتئین همچنان با هدایت gRNA قادر به اتصال به DNA در یک مکان مشخص در ژنوم با همان دقت بود. ویرایش ژنوم برخلاف حذف دائمی توسط مهندسی ژنوم، سیستم CRISPR/dCas مدولاسیون برگشت پذیر بیان ژن را تحریک می کند، و برای دستیابی به این، دو فناوری جداگانه توسعه داده شده است، که در آن فرآیند سرکوب رونویسی به عنوان تداخل CRISPR (CRISPRi) نامیده می شود و فعال سازی رونویسی است. فعال سازی CRISPR (CRISPRa) نامیده می شود. تا به امروز، این سیستم ها به طور گسترده، خارج از زمینه ویرایش ژن، برای تعدیل بیان چندین ژن و شناسایی عملکردهای سلولی آنها به کار گرفته شده اند. 

کریسپر کس و نقش آن در مبازه با مقاومت آنتی بیوتیکی

ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری ها یک تهدید بزرگ برای سلامت عمومی است. نرخ آلودگی پاتوژن های مقاوم در برابر تقریباً همه ضد میکروبی ها همچنان در حال افزایش است، که منجر به توسعه استراتژی های مختلف برای مبارزه با مقاومت ضد میکروبی شده است. 

سیستم دفاعی باکتریایی در برابر نوع خود

سیستم CRISPR-cas می تواند بین گونه های مشترک و بیماری زا به دلیل هدف گیری توالی بسیار خاص تمایز قائل شود. RNA های راهنمای CRISPR را می توان برای هدف قرار دادن ژن های هدف و کروموزومی که مخصوص پاتوژن ها هستند طراحی کرد، در نتیجه سیستم CRISPR-cas را قادر می سازد به جای دفاع در برابر مهاجمان، در برابر باکتری ها تغییر کاربری دهد. فناوری CRISPR-cas9 می تواند برای تولید آنتی بیوتیک های توالی خاص با توانایی هدف قرار دادن تنها پاتوژن های AMR استفاده شود. Cas9 یک نوکلئاز DNA دو رشته‌ای است که می‌توان آن را برنامه‌ ریزی کرد یا از آن برای جدا کردن هر توالی DNA استفاده کرد. پیش از این، دانشمندان E. coli و Staphylococcus aureus را با یک پلاسمید کد کننده RNA های هدایت شونده cas9 که دقیقا ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک را تخریب می کرد، تبدیل کردند. Cas9 برنامه ریزی شده با توالی های هدف خاص می تواند سمیت سلولی، سلول های مقاوم را افزایش دهد. این بدان معناست که پاتوژن های AMR را می توان با برش دقیق ژن های مقاوم با کمک سیستم CRISPR-cas9 به سلول های حساس به آنتی بیوتیک بازگرداند.

ورود کریسپر کس 9 به داخل باکتری های گرم منفی ومثبت

مانع اصلی در تحویل آنتی باکتریال CRISPR-cas9، ورود کمپلکس 160 کیلو دالتون پروتئین از طریق غشای باکتری است. برای حل این مشکل، بسیاری از محققان از فاژهای خاص به عنوان وسیله نقلیه برای تحویل CRISPR-cas  استفاده کردند. فاژها شکارچیان طبیعی باکتری ها هستند که DNA خود را به باکتری ها تزریق می کنند. در سال 2014، گزارش شد که CRISPR-cas9 که برای هدف قرار دادن ژن‌های کروموزومی خاص باکتری‌ها طراحی شده است، می‌تواند با کد گذاری ژنتیکی فاژمید در کپسیدها (پوشش پروتئینی) فاژهای بی‌اثر محصور شود. فاژمید یک پلاسمید است که برای بسته بندی در کپسیدهای فاژ طراحی شده است. مطالعه دیگری گزارش داد که فاژ اصلاح شده ژنتیکی دارای CRISPR-cas9 می تواند مقاومت آنتی بیوتیکی در استافیلوکوکوس اورئوس را هدف قرار دهد. روی هم رفته، این یافته‌ها نشان داد که آنتی‌باکتری‌های CRISPR-cas9 برای باکتری‌های بیماری‌زا و گونه‌های غیر بیماری‌زا بسیار اختصاصی هستند، که یک نیاز اساسی برای توسعه آنتی‌بیوتیک‌های جدید جدید است. این یافته‌های آزمایشگاهی جذابیت فاژها را به عنوان وسیله‌ای برای تحویل CRISPR-cas9 برای کشتن سریع پاتوژن‌های مقاوم نشان می‌دهد.
علاوه بر این، گروه‌های دیگر پتانسیل CRISPR-cas9 را در حذف باکتری‌های مقاوم از جمعیت‌های باکتریایی پیچیده بررسی کرده‌اند. داربست های فاژی را برای افزایش گسترش دامنه میزبان مهندسی کرده است، و دیگران استراتژی های ویرایش ژن را برای حساس کردن مجدد باکتری ها در برابر آنتی بیوتیک ها بررسی کرده اند. این نتایج از استفاده مجدد از سیستم CRISPR-cas9 برای استفاده در برابر عفونت‌های AMR و سویه‌های باکتریایی تازه ظهور پشتیبانی می‌کند. CRISPR-cas9 با تغییر توالی RNA راهنما بسیار سازگار و قابل برنامه ریزی است. با این حال، روش‌های مورد استفاده برای کپسوله‌ سازی هر دو sgRNA و پروتئین، استفاده عملی آنها را به دلیل بازده بارگذاری و بسته‌بندی کم محدود می‌کند. علاوه بر این، نیاز به دوز تجویزی بالا ممکن است باعث ایجاد مشکلات سمیت شود.

تحول کریسپر کس در واحد نانو

 اخیرا یک تیم تحقیقاتی روشی برای ویرایش ژنوم غیر ویروسی ایجاد کرده اند که در آن با موفقیت از کمپلکس CRISPR در اندازه نانو برای هدف قرار دادن ژن mecA استفاده کردند. آنها از پروتئین cas9 مشتق از پلیمر استفاده کردند که به صورت کووالانسی با پلیمر کاتیونی اصلاح شده است. آنها ادعا کردند که کمپلکس CRISPR در اندازه نانو (Cr-Nanocomplex) بدون ایجاد اختلال در فعالیت CRISPR-cas9 برش DNA با موفقیت تشکیل شد. Cr-Nanocomplex به طور خاص برای هدف قرار دادن ژن mecA طراحی شده است. این ژن در مقاومت به متی سیلین نقش دارد و می تواند به طور موثر به استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (MRSA) تحویل داده شود و امکان ویرایش کارآمد ژنوم باکتری را نسبت به کمپلکس cas9 بومی یا فرمولاسیون سنتی مبتنی بر لیپید فراهم کند. این کار قویاً نشان می‌دهد که CRISPR-cas9 را می‌توان برای حمله به پاتوژن‌های AMR تغییر کاربری داد.
با این حال، این روش‌ها فقط عفونت‌های خارجی و درمان‌شده موضعی مانند MRSA را بررسی می‌کنند. بنابراین، استراتژی‌های دیگری برای پاتوژن‌های درون سلولی سیستمیک برای درمان عفونت‌های خاص بافت و اندام مورد نیاز است.

تحویل داخل سلولی آنتی باکتریال های CRISPR-cas9

همانطور که قبلا توضیح داده شد، ژنوم فاژهای کدگذاری شده ژنتیکی می توانند برای انتقال آنتی باکتریال های CRISPR-cas9 به باکتری ها استفاده شوند. هنگامی که باکتری های بیماری زا درون سلولی هستند، تحویل آنتی باکتریال های CRISPR-cas9 چالش برانگیزتر می شود. در این حالت، CRISPR-cas9 کدگذاری شده در فاژ باید برای هدف قرار دادن خاص سلول‌های آلوده، قبل از انتشار آن در باکتری‌های ساکن در سلول‌ها استفاده شود. این فرآیند تحویل به دلیل ویژگی برای هر دو لایه (سلول میزبان و باکتری های داخل سلولی) پیچیده است.
پس از توسعه داروی جدید، اثربخشی آن در ماتریس ها برای تحویل و درمان کارآمد بزرگترین چالش است. اصلاح خواص شیمیایی یک دارو برای تحویل، هزینه درمان را با برخی از مزایای اضافی، مانند دور زدن سلول های سالم و نیاز به دوز کمتر، کاهش می دهد. رویکردهای متعددی برای استفاده از CRISPR-cas9 برای ویرایش سلول میزبان انسانی وجود دارد. با این حال، این استراتژی‌ها فقط با سلول‌های هدف انسانی سروکار دارند و چالش‌های مرتبط با تحویل CRISPR-cas9 کدگذاری شده در فاژها برای مبارزه با عفونت‌های داخل سلولی را بررسی نمی‌کنند. علاوه بر این، تنوع در اندازه و ساختار فاژهای مختلف باید در نظر گرفته شود. برای غلبه بر این چالش‌ها، CRISPR-cas9 یک استراتژی ارائه می‌کند که می‌تواند به توسعه آنتی‌باکتری‌های قابل برنامه‌ریزی کمک کند که می‌توانند به صورت ژنتیکی به ژنوم فاژ تغییر یابند. علاوه بر این، تحویل CRISPR-cas9 به سلول‌های میزبان آلوده توسط فاژهای کدگذاری شده، پیشرفتی را نسبت به استراتژی‌های تحویل موجود در حال حاضر فراهم می‌کند.

فاژهای کد کننده CRISPR-cas9

مشخص است که فاژها دارای تنوع ساختاری هستند. بنابراین، استراتژی های سنتی مانند استفاده از نانوذرات به عنوان حامل عملی نیستند. از نانوذرات متخلخل مختلف به عنوان حامل برای دارو رسانی استفاده می‌شود، اما این روش‌ها زمانی که از فاژهای بزرگ و غیر متقارن استفاده می‌شود، به دلیل محدودیت در اندازه منافذ، مؤثر نیستند. برای حل این مسائل، لازم است باکتریوفاژها را کپسوله کنیم تا آنها را برای اهداف درمانی تثبیت کنند. تحقیقات نشان داده است که می‌توان مستقیماً خود مونتاژ کپسولاسیون فاژ (محموله‌های باکتریایی) را در ساختارهای ذرات مبتنی بر لیپید و سیلیس ایجاد کرد. فرمول‌های شیمیایی برای کپسوله‌ سازی، مانند دوپینگ در سیلیس و پروتئین‌های تثبیت‌ کننده، می‌توانند با استفاده از اجزای مختلف بیولوژیکی اصلاح شوند. فاژهای محصور شده بر پایه سیلیس می توانند از سیستم ایمنی فرار کنند و در عین حال عملکرد بیولوژیکی طبیعی خود را حفظ کنند. این استراتژی می تواند به غلبه بر مشکل سد دوگانه برای درمان عفونت های باکتریایی داخل سلولی مانند Burkholderia pseudomallei کمک کند.
فاژهای کد کننده CRISPR-cas9 فرصتی را برای تحویل گونه های خاص آنتی باکتریال ها فراهم می کنند. علاوه بر این، سازگاری CRISPR-cas9 به توسعه سریع بیولوژیک ها برای مقابله با عفونت های پاتوژن AMR اجازه می دهد. اکنون امکان ساخت کتابخانه RNA های راهنمای CRISPR-cas9 برای مبارزه با پاتوژن های AMR در حال تکامل وجود دارد.

خلاصه

پاتوژن های AMR یک نگرانی عمده برای سلامت عمومی در سراسر جهان هستند. استراتژی های مختلفی برای مقابله با افزایش AMR ایجاد شده است. در میان آنها، یک تکنیک جدید توسعه یافته به نام سیستم CRISPR-cas زرادخانه ای را در جنگ علیه پاتوژن های مقاوم به ارمغان می آورد. با کمک سیستم CRISPR-cas، دانشمندان پاتوژن های مقاوم به آنتی بیوتیک خارج سلولی (عفونت MRSA) و داخل سلولی (B. pseudomallei) را درمان می کنند. با این حال، استفاده از آنتی‌باکتری‌های CRISPR-cas9 در برابر پاتوژن‌های مقاوم غیرآزمایشگاهی هنوز یک چالش است.