انواع مختلف سیستم CRISPR-cas و نقش آن در مواجهه با تهدید مقاومت آنتی بیوتیکی

ترکیبات آنتی بیوتیکی تقریباً از 90 سال پیش به طور قابل توجهی بر پزشکی مدرن تأثیر گذاشته است. در حالی که آنتی‌بیوتیک ‌ها می‌توانند بر عفونت‌ های کشنده غلبه کنند، استفاده غیرمنطقی آن‌ها در دامپزشکی و کشاورزی یک تهدید بزرگ محسوب می شود، زیرا منجر به جریان عظیم آنتی‌بیوتیک‌ها در محیط می‌شود. این قرار گرفتن در معرض بسیاری از آنتی بیوتیک ها منجر به فشار های انتخابی عظیمی می شود که باعث گسترش و تکامل ژن های مقاومت ضد میکروبی در باکتری های بیماری زا و مشترک می شود. این ژن‌های مقاوم به آنتی‌ بیوتیک، باکتری ‌ها را قادر می‌سازند تا از طریق مکانیسم ‌های مختلف، از جمله استفاده از پمپ خروجی، غیرفعال‌ سازی مولکول آنتی ‌بیوتیک توسط آنزیم ‌ها، و اصلاح شیمیایی (ریبوزوم و دیواره سلولی) برای محافظت از اهداف سلولی آنتی‌بیوتیک‌ ها، بر آنتی‌بیوتیک ‌ها غلبه کنند. روی هم رفته، این مکانیسم‌ های مقاومت تهدیدی برای اثربخشی آنتی‌بیوتیک ‌های مورد استفاده در درمان هستند. مرکز کنترل و پیشگیری از بیماری ها در سال 2013 گزارش داد که پاتوژن های مقاوم به ضد میکروبی (AMR) بیش از 2 میلیون نفر را در هر سال آلوده می کنند که منجر به مرگ 23000 نفر می شود. همچنین پیش‌بینی می‌شود که پاتوژن‌های مقاوم به دارو تا سال 2050 باعث مرگ 10 میلیون نفر در سال خواهند شد. یکی از عوامل موثر در ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی، توانایی باکتری ها در اتخاذ ناهمگونی فنوتیپی و ژنوتیپی باور نکردنی برای بقا در محیط های نامطلوب است.
AMR عامل اصلی کاهش تولید آنتی بیوتیک جدید است: هیچ کلاس آنتی بیوتیک جدیدی برای عفونت های باکتریایی گرم منفی در بیش از 45 سال تایید نشده است و تنها 37 داروی آنتی بیوتیک در حال حاضر در فاز II یا III آزمایشات بالینی هستند. علاوه بر این، توسعه آنتی بیوتیک، غربالگری و آزمایش بسیار پر هزینه می باشد. این عوامل ما را مجبور به جستجوی درمان های جایگزین برای پاتوژن های AMR، از جمله توسعه یک زرادخانه ضد باکتری منحصر به فرد با قابلیت های هدف دقیق کرده است. برای دستیابی به این هدف، محققان آنتی‌ باکتری ‌هایی مبتنی بر پپتید و اسید نوکلئیک، درمان‌ های باکتریوفاژ، باکتریوسین ‌ها، آنتی‌ بادی ‌ها و ترکیبات ضد ویروسی و غیره را توسعه داده‌اند. سیستم تکرارهای کوتاه پالیندرومیک (CRISPR) با فاصله منظم خوشه‌ای و نقش آن در غلبه بر تهدید رو به رشد  AMR.

تاریخچه سیستم  CRISPR-cas

داستان سیستم CRISPR-cas در سال 1987 آغاز شد، زمانی که ناکاتا و همکارانش مجموعه ای از 29 نوکلئوتید  را در طی مطالعه ژن iap در E. coli گزارش کردند. با تعیین توالی ژنوم های میکروبی متعدد در دهه آینده، عناصر تکراری اضافی از ژنوم سویه های مختلف باکتریایی نیز گزارش شد. بعداً، این خانواده منحصربه‌فرد از توالی‌های تکراری با فاصله به عنوان عناصر تکرار خوشه‌ای نامیده شدند. در سال 2005 بود، زمانی که توالی های فاصله دهنده از تکرارهای مستقیم جدا شدند که نشان دهنده ارتباط فاژی یا منشاء خارج کروموزومی آنها بود. در سال 2010، عملکرد و مکانیسم اساسی سیستم CRISPR-cas مشخص شد. این سیستم از یک مکان ژنتیکی با توالی‌های غیر تکراری فاصله‌گر و 6 تا 20 ژن مجاور تشکیل شده است که پروتئین‌های مرتبط با CRISPR (cas) را کد می‌کنند. امروزه تعدادی از محققان شروع به استفاده از سیستم CRISPR-cas برای کاربردهای بیوتکنولوژیکی و تولید کشت های لبنی مقاوم به فاژ کرده اند.

عملکرد سیستم CRISPR-cas

سیستم CRISPR-cas یک سیستم ایمنی تطبیقی از باکتری ها است که از باکتری ها در برابر مهاجمان از جمله باکتریوفاژها یا فاژها و عناصر ژنتیکی متحرک (MGEs) محافظت می کند. سیستم CRISPR-cas عناصر ژنتیکی خارجی را در سه مرحله تجزیه می کند. تطبیق یا اکتساب اسپیسر اولین مرحله ای است که در آن توالی فاصله ساز پس از شناسایی در آرایه CRISPR ادغام می شود. مرحله دوم بیوژنز یا بیان CRISPR RNA (crRNA) است که در آن RNA pre-CRISPR (pre-crRNA) توسط RNA پلیمراز (RNAP) رونویسی می شود. سپس این pre-crRNA توسط اندوریبونوکلئازهای خاص به crRNA کوچک تقسیم می‌شوند. بر اساس عملکرد crRNA ها، اینها به عنوان RNA های راهنما نیز شناخته می شوند. مرحله نهایی که در آن crRNA ها جفت باز مخصوص RNA یا DNA خارجی را با مکمل تقریباً کامل تشکیل می دهند. این کار منجر به برش کمپلکس crRNA- اسید نوکلئیک خارجی می شود. برعکس، اگر هر گونه جهش در موتیف مجاور پروتو اسپیسر (PAM) یا عدم تطابق بین DNA فضاساز و مهاجم وجود داشته باشد، شکاف رخ نمی‌دهد و میزبان مستعد عفونت است.

انواع مختلف سیستم  CRISPR-cas

سیستم CRISPR-cas به سه زیرگروه تقسیم می شود: سیستم CRISPR-cas نوعI، II  و III 

این طبقه بندی بر اساس ژن های موجود در هر نوع انجام شده است. به عنوان مثال، نوع I دارای cas3، نوع II دارای cas9 و نوع III دارای ژن cas10 است. با این حال، ذکر این نکته ضروری است که همه انواع و زیرگروه‌های سیستم CRISPR دارای پروتئین‌های cas1 و cas2 هستند، زیرا این دو پروتئین نقش کلیدی در اسپیسر دارند.

سیستم نوع یک

سیستم CRISPR-cas نوع I در اکثر باکتری ها وجود دارد. این سیستم بیشتر به شش زیر گروه (A-F) تقسیم می شود که ژن cas3 را کد می کند. Cas3 یک پروتئین چند دامنه ای با فعالیت هلیکاز و نوکلئاز است. پروتئین Cas3  شامل دو حوزه است: یک فوفوهیدرولاز HD ترمینال برای برش DNA و یک دامنه C ترمینال هلیکاز .
این دو حوزه با هم کار می کنند تا DNA مهاجم را تجزیه کنند. با این حال، cas3  به تنهایی قادر به شناسایی DNA  مهاجم و محافظت از سلول ها در برابر عفونت نیست. در هر زیرگروه از سیستم نوع I، تعدادی از پروتئین‌های زیرنوع خاص cas جمع می‌شوند تا مجموعه‌ای به نام مجتمع نظارتی هدایت‌شده crRNA یا مجتمع مرتبط با CRISPR  برای دفاع ضد ویروسی (CASCADE) را تشکیل دهند. این کمپلکس‌ها در شناسایی و اتصال توالی هدف مکمل فاصله‌گذار crRNA نقش دارند. مجموعه نظارت هدایت شده crRNA برای اولین بار در E. coli توصیف شد. این کمپلکس ترکیبی از پنج پروتئین cas است Cas6e که قبلاً Cas3e یا CasE نامیده می شد به بلوغ crRNA کمک می کند.crRNA  بالغ متصل به کمپلکس CASCADE باقی می ماند و نقشی در تشخیص و برش DNA مهاجم دارد.

سیستم نوع دوم

این سیستم فقط در باکتری ها وجود دارد. در مقایسه با سایر انواع CRISPR-cas، سیستم نوع II ساده ترین است. سیستم CRISPR-cas نوع II دارای چهار ژن است: cas1، cas2، cas9، وcas4. 
 ژن cas9 شامل دو حوزه RuvC و HNH است. دامنه HNH به برش DNA کمک می کند که مکمل راهنمای crRNA  است، در حالی که دامنه RuvC در برش رشته غیر مکمل نقش دارد. بیوژنز crRNA در سیستم نوع II  به یک crRNA فعال کننده ترانس (tracrRNA) نیاز دارد. رمزگذاری tracrRNA در استرپتوکوک پیوژنز در رشته مخالف مکان CRISPR-cas انجام می شود. هیبریداسیون بین تکرارهای crRNA و tracRNA منجر به تشکیل RNA دو رشته ای (dsRNA) می شود که توسط آنزیم سلولی غیر cas RNase III شناسایی و بریده می شود. بیوژنز crRNA با حذف ژن cas9 مهار می شود. با این حال، نقش آن در بیوژنز crRNA نامشخص است. محققان نشان دادند که آنزیم cas9 به هر دو tracrRNA و crRNA برای برش DNA هدف نیاز دارد. قابل ذکر است، تمام حوزه های لازم برای برش DNA در یک پروتئین منفرد (cas9) ادغام می شوند که سیستم CRISPR-cas  نوع II را به یک انتخاب ایده آل برای دستکاری ژنوم تبدیل می کند.

سیستم نوع سه

سیستم نوع III به دو زیر گروه تقسیم می شود: نوع III-A و نوعIII-B.
 این سیستم بیشتر در archaea وجود دارد، اما همچنین گزارش شده است که سیستم نوع III-B تنها در ارتباط با سایر انواع CRISPR وجود دارد. سیستم CRISPR-cas نوع III هر دو ژن cas6 و cas10 را رمزگذاری می کند. Cas10 به عنوان پروتئین مرموز مرتبط با تکرار (RAMP) شناخته می شود و به طور بالقوه در بلوغ crRNA و برش DNA نقش دارد. Cas6 یک اندوریبونوکلئاز است که با کمپلکس CASCADE مرتبط نیست و به طور مستقل عمل می کند. کمپلکس CASCADE از سیستم نوع III به crRNA بالغ متصل می شود و RNA خارجی را می شکافد. 
اگرچه این دو نوع از سیستم CRISPR-cas نوع III دارای شباهت هایی هستند، به نظر می رسد که این دو سیستم بسترهای شیمیایی متفاوتی را هدف قرار می دهند. به عنوان مثال، سیستم نوع III-A اپیدرمیدیس DNA را هدف قرار می دهد در حالی که سیستم نوع III-B در S. solfataricus و Pyrococcus furiosus وجود دارد. این نشان دهنده تنوع سیستم CRISPR در سیستم های نوع III است.

نقش سیستم CRISPR-cas در واگیری باکتریایی

چندین مطالعه نشان داده اند که سیستم CRISPR-cas به غیر از دفاع از باکتری ها در برابر مهاجمان، عملکردهای دیگری نیز دارد. این سیستم در رونویسی درون زا را کنترل می کند و در تنظیم بیماری زایی باکتری ها نقش دارد. به عنوان مثال، فرانسیسلا نوویسیدا، یک عامل احتمالی بیماری در انسان، با دور زدن سیستم ایمنی میزبان در داخل سلول تکثیر می شود. این باکتری مکانیسم های مختلفی برای براندازی ماکروفاژهای میزبان و سایر عملکردهای سلول های ایمنی دارد.
پس از غرق شدن توسط ماکروفاژها، F. novicida  وارد فاگوزوم می شود، محفظه ای که دارای چندین ضد میکروبی و گیرنده های تشخیص ایمنی است. گیرنده 2 شبه تلفن (TLR2) یکی از گیرنده هایی است که می تواند لیپوپروتئین های باکتریایی (BLPs) را شناسایی کند. فعال سازی TLR2 یک پاسخ پیش التهابی را آغاز می کند و سلول های ایمنی را به خدمت می گیرد و همچنین سلول های ایمنی را فعال می کند، این در نهایت به پاکسازی پاتوژن باکتریایی کمک می کند.

دخالت سیستم CRISPR-cas در مقاومت ضد میکروبی

مطالعات متعددی وجود دارد که سیستم CRISPR-cas را در مقاومت ضد میکروبی نقش دارد. به عنوان مثال، این سیستم یکپارچگی پوشش F. novicida را با تنظیم BLP ارتقا می دهد. این منجر به ایجاد مقاومت در برابر چندین عامل استرس زا از جمله آنتی بیوتیک ها می شود. یک مطالعه جداگانه رابطه بین سیستم‌های صلاحیت و سیستم CRISPR را نشان داد: سویه‌های ذیصلاح Aggregatibacter actinomycetemcomitans دارای سیستم CRISPR-cas هستند، در حالی که سویه‌های باکتریایی غیر صالح سیستم ایمنی CRISPR خود را از دست دادند. این یافته نشان داد که تکامل سیستم شایستگی و CRISPR ها ناهمگنی ژنتیکی و ظهور گونه های باکتریایی جدید را ارتقا می دهد. باکتری هایی که دارای سیستم CRISPR هستند ممکن است مقاومت پیدا کنند که می تواند منجر به جمعیتی از باکتری ها با تناسب بیشتر نسبت به سایر انواع شود.
همچنین توجه به این نکته مهم است که سیستم CRISPR از ژنوم میزبان در برابر مهاجمان برای حفظ هموستاز ژنتیکی محافظت می کند. عناصر ژنتیکی خارجی، مانند پلاسمیدها و سایر عناصر مزدوج، ممکن است حامل ژن های مفیدی باشند که ممکن است تناسب باکتری ها را در محیط افزایش دهند، مانند واگیری و مقاومت آنتی بیوتیکی.
همانطور که در Enterococcus، Campylobacter  و بسیاری از گونه های استرپتوکوک گروه A توضیح داده شده است، چندین مطالعه یک همبستگی منفی بین سیستم CRISPR-cas و حضور پلاسمیدها و فاژها پیدا کرده اند. یک مطالعه نشان داد که هدف قرار دادن پلاسمید توسط سیستم CRISPR-cas منجر به اثرات نامطلوب در S. epidermidis در مورد مقاومت آنتی بیوتیکی آن می شود.

استفاده از سیستم CRISPR-cas برای مواجهه با تهدید مقاومت آنتی بیوتیکی

چهار دسته اصلی از پروتئین‌های متصل‌شونده به DNA برای دستیابی به ویرایش مؤثر ژنوم مهندسی شده‌اند: مگانوکلئازهای منشأ گرفته از MGEهای میکروبی، فعال‌کننده‌های رونویسی (TALEs) مشتق شده از باکتری‌ها (Xanthomonas)، نوکلئازهای انگشت روی (ZFNs) از فاکتورهای رونویسی یوکاریوتی و در نهایت RNA اندونوکلئازهای، DNA هدایت شده cas9 از سیستم باکتریایی CRISPR-cas نوع II
ویرایش ژنوم توسط مگانوکلئازها به دلیل ویژگی کم توالی برای DNA هدف به طور گسترده مورد استفاده قرار نمی گیرد. ZFN همچنین دارای محدودیت هایی هستند، زیرا طراحی آنها برای اتصال به یک دنباله دلخواه دشوار است. علاوه بر این، ZFN  ها انتخاب سایت هدف محدودی دارند. طراحی TALEN ها به دلیل ظرفیت آنها برای داشتن دامنه های پروتئینی متصل به DNA طولانی تر، طراحی آسان است و این امکان را برای هدف گذاری با ویژگی بالا فراهم می کند. با این حال، TALEN ها بسیار بزرگتر از ZFN ها هستند و این اندازه برای تحویل به سلول ها عارضه ای ایجاد می کند.
نوکلئاز Cas9 سیستم CRISPR-cas نوع II از یک RNA راهنما برای شناسایی DNA هدف با جفت شدن بازهای Watson-Crick  استفاده می کند. توالی های موجود در RNA های راهنمای CRISPR مخصوص یک توالی مهاجم هستند، به این معنی که این توالی می تواند به راحتی با توالی مورد نظر ما جایگزین شود تا نوکلئاز CRISPR-cas9  را دوباره هدف قرار دهد.
حذف و جهش ژن های مورد نظر تقریبا هر گونه، و حتی می تواند برای اصلاح بیماری های ژنتیکی در حیوانات زنده استفاده شود. علاوه بر این، این سیستم در حال حاضر در آماده‌سازی‌های ضد باکتریایی خاص استفاده می‌شود که می‌توانند پاتوژن‌های AMR را در جمعیت‌های پیچیده باکتری‌ها مورد هدف قرار دهند، امکان تحویل آنتی‌باکتریایی به باکتری ‌های بیماری ‌زا را فراهم کنند و در برخی موارد درمان ‌هایی را به سلول‌ های میزبان آلوده به باکتری ‌های بیماری ‌زا ارائه دهند. سیستم CRISPR-cas بین گونه‌های باکتریایی مشترک و بیماری ‌زا به دلیل هدف‌گیری خاص توالی تمایز قائل می‌شود. بنابراین پتانسیل سیستم CRISPR-cas برای مقابله با پاتوژن های AMR در اینجا برجسته شده است.