واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) چیست ؛ اساس و نحوه انجام آن

PCR چیست؟

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) به‌منظور ساخت میلیون‌ها کپی از قطعه DNA موردنظر، به‌کارمی‌رود. این تکنیک برای نخستین بار در سال ۱۹۸۳ توسط Kary Mullis، شیمی‌دان آمریکایی، ابداع شد. وی به مناسبت این دستاورد مهم در سال ۱۹۹۳ برنده جایزه نوبل گردید. PCR امکان تولید میلیون‌ها نسخه از یک قطعه مشخص موجود در مقادیر اندک DNA را فراهم می‌کند.

تکنیک PCR در واقع انقلابی عظیم را در بیولوژی مولکولی پدید آورد و باعث افزایش روزافزون دانش ما در حوزه مطالعات ژنومی گردید. امروزه با استفاده از PCR قادر به استخراج هر ژنی از هر سلولی هستیم.  تکرارپذیری، سرعت و حساسیت بسیار بالای تکنیک PCR، آن را به روشی معمول در تحقیقات آزمایشگاهی پزشکی و زیست‌شناسی تبدیل کرده است.

عدم نیاز به باکتری‌ها برای تکثیر، PCR را به روشی سریع و آسان تبدیل کرده‌است؛ خصوصا اگر توالی کامل ژنوم ارگانیسم مشخص باشد. این روش تکنیکی معمول در تحقیقات آزمایشگاهی پزشکی و زیست‌شناسی است و از آن در تشخيص بيماري‌هاي قبل از تولد، تعيين جنسيت جنين، تشخیص بیماری ها، تشخیص سرطان و بررسی مراحل درمان آن، تحقیقات جنایی، تحقیقات ژنومی، انگشت نگاری ژنتیکی،  تکثیر DNA برای توالی‌یابی، تشخیص عوامل عفونی استفاده می‌شود. به دلیل بالا بودن حساسیت PCR  مقدار کم DNA موجود در قطره خون به‌جامانده در صحنه جرم، و یا نسخه‌های اندکی از ژنوم ویروسی موجود در خون بیمار قابل تشخیص خواهد بود.

اساس واکنش PCR چیست و چگونه انجام می‌گیرد؟

تکنیک PCR با کپی برداری از اصول فرایند طبیعی همانندسازی مولکول  DNA در سلول طراحی شده است. در داخل سلول‌های زنده، دو رشته DNA با کمک آنزیمها از هم باز می‌شوند و هر رشته از مولکول مادر به عنوان الگویی برای تولید رشته‌های مکمل مورد استفاده قرار می‌گیرد. اساس همانند سازی، قانون چارگف و اصل جفت شدن بازهای مکمل با یکدیگر است. نوکلئوتید A همواره با T و نوکلئوتید G همواره با C جفت می‌شوند.

برای انجام PCR مواد و ابزاری مورد نیاز است که عبارتند از:

1) نمونه DNAای که قرار است از آن نسخه های متعددی تکثیر یا یک ناحیه خاص از آن جدا گردد.
2) توالی های کوتاهی از DNA به نام پرایمرها، که آغازگر PCR هستند. پرایمرها باید به‌گونه‌ای طراحی ‌شوند که بتوانند از سمت ´۳ هر دو رشته به توالی موردنظر در DNA هدف متصل شوند لذا به دو نوع پرایمر معکوس و مستقیم نیاز داریم.
3) نوکلئوتیدها (dNTPها) که مونومرهای سازنده DNA بوده و برای ساخت رشته جدید مورد نیاز می‌باشند.
4) آنزیم Taq پلیمراز که نوکلئوتیدها را بر اساس رشته الگو  به رشته جدید DNA می‌افزاید.
5) محلول واکنش (PCR Mix) که حاوی یونها و سایر مواد مورد نیاز انجام آزمایش PCR میباشد.
6) دستگاه ترمال سایکلر

*** در PCR مراحل گرم و سرد کردن به‌صورت پشت سر هم توسط ترمال سایکلر صورت می‌گیرد لذا این فرآیند را چرخه حرارتی مینامند.

آزمایش PCR سه مرحله اصلی دارد:

1) دناتوراسیون : (Denaturation) DNA دورشته‌ای حرارت داده می‌شود تا به دو DNA تک‌رشته‌ای تبدیل شود.
2) اتصال (:(Annealing دما به میزانی پایین آورده می‌شود تا پرایمرها بتوانند به رشته الگو متصل شوند.
3) گسترش (Extention): با افزایش دما، رشته جدید توسط آنزیم Taq پلیمراز شروع به طویل شدن می‌کند.

این سه مرحله، ۲۰ الی ۴۰ بار تکرار می‌شوند و در هر مرتبه تعداد کپی‌های تهیه شده از هر DNA دو برابر می‌شود.

همانطور که گفته شد هر چرخه PCR شامل سه مرحله است. در مرحله اول مرحله (دناتوراسیون) DNA دو رشته‌ای حرارت داده می‌شود تا دو رشته آن از هم جدا شوند. طی این مرحله تمام پنج جزء اصلی نام‌برده‌شده از جمله DNA الگو تا دمای ۹۵-۹۴ درجه سانتیگراد حرارت داده‌می‌شوند. دمای بالا باعث از هم گسستن پیوندهای هیدروژنی بین بازها شده و دو رشته DNA جداگانه حاصل می‌گردد. این دو رشته به‌عنوان الگویی برای ساخت رشته‌های جدید DNA عمل می‌کنند. و DNAهای تک رشته در معرض تعداد فراوانی از دو نوع پرایمر مشخص قرار می‌گیرد مدت زمان افزایش دما تا این حد باید به میزانی باشد که تمام مولکول‌های DNA دو رشته‌ای شوند. این فرایند معمولا ۳۰-۱۵ ثانیه طول می‌کشد.

در مرحله دوم (مرحله اتصال) نمونه باید سرد شود تا پرایمرها بتوانند به توالی مکمل خود متصل شوند. در این مرحله، دما تا حدود ۶۵-۵۰ درجه سانیگراد پایین می‌آید. درنتیجه پرایمرها با پیوند هیدروژنی به نقاط اتصال مخصوص به خود در DNA تک رشته‌ای متصل می‌شوند. البته دمای دقیق به نقطه ذوب پرایمر مورد استفاده بستگی دارد.

پرایمرها توالی‌های تک‌رشته‌ای DNA یا RNA هستند که طولی به اندازه ۳۰-۲۰ باز دارند و انتهای ۳ پرایم مورد نیاز برای آغاز فعالیت پلیمراز و سنتز DNA را تهیه می‌کنند.

پرایمرها توسط آزمایش‌گر به گونه‌ای طراحی و ساخته می‌شوند که توالی‌شان مکمل دو انتهای ۳ پریم توالی DNA موردنظر باشد. پرایمرها این توانایی را دارند که نقطه شروع قطعه را در هر دو رشته از ژنوم مکان‌یابی کنند.

پرایمرها به عنوان تعیین کننده نقطه شروع سنتز DNA جدید عمل می‌کنند؛ چون آنزیم DNA پلیمراز تنها می‌تواند بازهای جدید را به DNA دو رشته‌ای بیافزاید. پس از اتصال پرایمر است که پلیمراز نیز متصل شده و ساخت رشته مکمل را آغاز می‌کند.

دو رشته جدا شده DNA مکمل هم بوده ولی در دو جهت متفاوت قرار دارند (منظور از جهت نحوه قرارگیری انتهاهای ۳ پریم و ۵ پریم است). در نتیجه ۲ نوع پرایمر خواهیم داشت: Forward Primer و Reverse primer. به بیان دیگر، دو پرایمر به دو انتهای ۵ پریم موجود متصل می‌شود. این مرحله ۳۰-۱۰ ثانیه زمان می‌برد.

 در مرحله سوم (گسترش) مخلوط واکنش با DNA پلیمراز و ۴ نوع دئوکسی ریبونوکلئوتید تری ‌فسفات انکوبه می‌شود تا DNA از محل پرایمرها شروع به سنتز کند. طی این مرحله، دما تا ۷۲ درجه سانتیگراد افزایش داده می‌شود. درنتیجه آنزیم Taq DNA پلیمراز فعال شده و افزودن بازهای آلی و سنتز رشته جدید را از سمت ۵ پریم به ۳ پریم شروع می‌کند. دمای بهینه آنزیم Taq DNA پلیمراز ۷۲ درجه است. این آنزیم به پرایمر متصل شده و نوکلئوتیدها را به DNA تک رشته‌ای می‌افزاید.

مدت زمان این مرحله بستگی به طول توالی موردنظر دارد. کپی شدن هزار باز DNA حدود یک دقیقه زمان می‌برد.

Taq DNA- پلیمراز آنزیمی است که از نوعی باکتری گرمادوست به نام Thermus aquaticus گرفته‌شده‌است.

محیط زندگی این باکتری غالبا چشمه‌های آب گرم است و در نتیجه می‌تواند حرارت بالای ۸۰ درجه سانتیگراد را تحمل کند.

DNA پلیمراز باکتری، در دماهای بالا پایدار است. این به آن معنی است که می‌تواند دمای بالایی را که برای جدا کردن دو رشته DNA از همدیگر در مرحله دناتوراسیون مورد نیاز است، تحمل کند. در نتیجه افزودن آنزیم پس از هر بار انجام شدن چرخه، مورد نیاز نخواهد بود.

DNA پلیمراز بسیاری از ارگانیسم‌ها قادر به تحمل این دما نیست. به عنوان مثال، دمای مناسب برای فعالیت پلیمراز انسانی ۳۷ درجه سانتیگراد است.

با تکرار چرخه توضیح داده شده در شکل پیشین، قطعات جدید در چرخه‌های بعدی به عنوان الگو عمل می‌کنند. از آن‌جا که پلیمرازها و پرایمرها در مخلوط باقی می‌مانند، تنها کاری که باید انجام شود، گرم‌کردن و سردکردن پی‌در‌پی مخلوط است. هر چرخه مقدار DNA سنتز شده در چرخه‌های پیشین را دو برابر می‌کند؛ از این رو پس از چند چرخه، DNA غالب، نسخه‌های جدید تولیدشده از توالی موردنظر است. به عنوان مثال، مطابق شکل از ۳ چرخه انجام شده درمجموع ۱۶ عدد DNA تولید شده که ۸تای آن‌ها از لحاظ توالی منطبق بر یکی از دو رشته توالی دلخواه هستند. پس از سپری شدن ۴ چرخه دیگر، ۲۴۰ قطعه از کل ۲۵۶ قطعه تولیدشده، منطبق بر توالی موردنظر خواهند بود. معمولا پس از انجام ۲۰-۳۰ چرخه، کلون ناحیه موردنظر به شکل موثری انجام گرفته و غلظت بقیه ژنوم در مقایسه با ناحیه کلون‌شده، قابل چشم‌پوشی می‌شود.

چرخه حرارتی که شامل این سه مرحله است، ۲۰ تا ۴۰ مرتبه تکرار می‌شود و هر چرخه نیز حدود ۵ دقیقه به طول می‌انجامد تا کپی‌های فراوانی از قطعه DNA دلخواه‌مان تهیه شود.

قطعات DNA جدیدی که حین PCR تولید می‌شوند نیز به عنوان الگو عمل کرده و Taq DNA پلیمراز به این قطعات متصل شده و رشته جدید را تولید می‌کند. نتیجه تولید میلیون‌ها کپی از بخش خاصی از DNA در مدت زمانی بسیار کوتاه است.

PCR بهترین روش موجود برای تکثیر قطعات نسبتا کوتاه  DNA )کمتر از ۱۰۰۰۰ جفت نوکلئوتید) است. قطعات RNA نیز می‌توانند با روش PCR تکثیر شوند اما ابتدا باید به کمک آنزیم رونوشت بردار معکوس (Reverse Transcriptase) آنها را به cDNA تبدیل نمود که در مبحثی جداگانه به آن خواهیم پرداخت.

حساسیت  تکنیک PCR  بسیار بالاست و همین ویژگی آن را تبدیل به ابزاری مناسب برای تشخیص عوامل بیماری‌زا حتی در مراحل اولیه عفونت نموده است. بدین منظور لازم است پرایمرهای اختصاصی که مکمل ژنوم عامل بیماری‌زا هستند را طراحی و یا بصورت کیت های تجاری تهیه و مورد استفاده قرار داد که در اینصورت حتی نسخه‌های اندک ژنوم باکتریایی یا ویروسی نیز قابل تشخیص هستند.

پرایمرها

پرایمرها نقشی کلیدی و حساس در موفقیت یا عدم موفقیت واکنش PCR دارند لذا طراحی آنها نیازمند رعایت نکات مهممی است که عبارتند از:

1) طول مناسب: حدود ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتید
2) اختصاصیت پرایمرها: پرایمرها از لحاظ توالی باید بطور اختصاصی مکمل رشته هدف باشند
3) طول قطعه تکثیر شونده: در حالت ایده‌آل، قطعات DNA موردنظر نباید طولی بیش از ۳ کیلوباز و کمتر از یک کیلوباز داشته باشند. البته قطعاتی با طول بیش از ۱۰ کیلوباز نیز می‌توانند با تکنیک‌های PCR استاندارد تکثیر شوند، اما این امر باعث کاهش بازده فرایند تکثیر خواهد شد.
4) طول پرایمرها:  نکته مهم در سنتز پرایمر طول آنهاست. پرایمرهای کوتاه‌ ممکن است اتصال غیراختصاصی داشته باشند و محصولات غیراختصاصی تولید کنند. طول مناسب پرایمر ۱۸ تا ۲۲ باز می‌باشد و پرایمرهای با طول بیش از ۳۰ نوکلئوتید به ندرت مورد استفاده قرار می‌گیرند.
5) عدم تشکیل دایمر پرایمر و ساختارهای سنجاق سری: به منظور جلوگیری از اتصال پرایمرها به یکدیگر و تشکیل دایمر پرایمر اطمینان از مکمل نبودن بازهای داخل یک پرایمر با یکدیگر الزامیست. از همین رو توالی پرایمرها نباید محتوی توالیهای تکراری معکوس (inverted repeats) باشند. به منظور جلوگیری از تشکیل ساختارهای سنجاق سری درون هر یک از پرامرها لازم است که پرایمرها فاقد هر گونه توالی‌ self-complementary با طولی بیش از ۳ جفت‌باز باشند.
6) دمای ذوب پرایمرها :دمای ذوب پرایمرها (Tm)، دمایی است که نیمی از DNA دو رشته ای از هم جدا می شود و DNA تک رشته ای ایجاد می کند. بهترین پرایمرها آنهایی هستند که نقطه ذوبی بین 52 تا 58  درجه ی سانتی گراد داشته باشند.

7) دمای اتصال(Annealing) پرایمرها: دمای ذوب پرایمرها تخمینی از میزان پایداری هیبرید DNA-DNA است.  اگر دمای اتصال (Ta) خیلی بالا باشد، پرایمرها و الگو بهم متصل باقی نمی مانند و اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد اتصال ناقص نوکلئوتیدهای پرایمرها به الگو شکل می گیرد و محصولات غیر اختصاصی تولید می شود.
8) نسبت GC:  مقدار بازهای GC به کل بازها نباید بیش از ۶۰-۴۰ درصد باشد.

امروزه با استفاده از نرم افزارهای کارآمد مانند Oligo, Primer3 و Gene Runner به راحتی و در کمترین زمان پرایمرهایی با کیفیت تولید نمود.

جهت سفارش دستگاه ترمال سایکلر و ریل تایم پی سی آر از برندهای مختلف و کیت و مواد مصرفی مورد نیاز آن ها می توانید با کارشناسان فروش شرکت مبنا مد تماس حاصل نموده و در کنار مشاوره رایگان همواره بهترین انتخاب را داشته باشید.