واکنش زنجیره ای پلیمراز و پیشرفت در تشخیص بیماری های عفونی:

استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در تشخیص بیماری‌های عفونی، منجر به توانایی تشخیص زودهنگام و درمان مناسب بیماری‌های ناشی از پاتوژن‌های سریع، تعیین حساسیت ضد میکروبی ارگانیسم‌های آهسته رشد و تعیین کوانتوم عفونت شده است. این مقاله به تشریح PCR، برخی از اصلاحات آن و کاربرد آن در تشخیص بیماری های عفونی می پردازد.
مطالعه ساختار و عملکرد ژنتیکی به مقدار کافی DNA نیاز دارد که با استفاده از یک فرآیند دشوار شامل باکتری ها سنتز شد. یک روش ساده و شگفت‌آور برای ساختن کپی‌های نامحدود از قطعات DNA توسط کری مولیس در سال 1983 در طی یک رانندگی مهتابی در میان کوه‌های کشور چوب قرمز کالیفرنیای شمالی طراحی شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تکنیکی برای کپی کردن یک قطعه DNA در آزمایشگاه با واکنشگرهای در دسترس است. با هر مرحله از واکنش، تعداد مولکول های DNA به طور تصاعدی افزایش می یابد و در چند ساعت اجرای واکنش، بیش از 100 میلیارد نسخه ساخته می شود که به راحتی قابل تشخیص است. PCR به یک ابزار مهم در تشخیص سریع بیماری های عفونی تبدیل شده است.
واتسون و کریک در سال 1953 ساختار مارپیچ DNA دو رشته ای را پیشنهاد کردند، باز آدنین (A) به تیمین (T) و گوانین (G) به سیتوزین (C) متصل می شود. با افزایش دما، رشته‌ها از هم جدا می‌شوند (ذوب می‌شوند)، و دماهای پایین‌تر باعث می‌شوند که دوباره به هم بپیوندند (بازپخت)، و نوکلئوتیدها مجدداً ردیف می‌شوند تا ساختار مارپیچ دوگانه را به دست آورند. توالی های منحصر به فرد مولکول های DNA که برای پاتوژن کد می کنند توسط PCR شناسایی می شوند. این روش آسان‌تر و سریع‌تر از روش‌های سنتی سخت‌گیرانه برای کشت و شناسایی پاتوژن‌های سخت‌گیر است.

واکنش زنجیره ای پلیمرازPCR :

برای شناسایی یک پاتوژن توسط واکنش PCR، دانستن توالی نوکلئوتیدهایی که در کنار یک ناحیه منحصر به فرد روی DNA آن قرار دارند، ضروری است. بنابراین اولین مرحله در انجام این واکنش شناسایی توالی نوکلئوتیدی می باشد. سپس رشته های کوتاه DNA تک رشته ای به نام پرایمرها به صورت شیمیایی سنتز می شوند. پرایمرها مکمل توالی هایی هستند که در کنار منطقه منحصربه فرد قرار دارند. غلظت پرایمر چندین میلیون برابر DNA هدف است. دو پرایمر استفاده می شود، یکی برای بازپخت به رشته حسی طراحی شده است، دیگری برای بازپخت به رشته ضد حس طراحی شده است. آغازگرها با محلول بافری از DNA الگو، نوکلئوتیدها (dNTPs)، کلرید منیزیم و DNA پلیمراز مخلوط می شوند.

DNA پلیمرازهای قبلی توسط گرما دناتوره(ساختار آن ها شکسته شده) شدند و پس از هر چرخه دناتوره سازی نیاز به دوباره سازی داشتند. یک DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت به نام Taq polymerase از باسیل Thermus acquaticus (که در چشمه های آب گرم یافت می شود) مشتق شده است. این DNA پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت، تکنولوژی PCR را متحول کرده و واکنش را با یک افزودن تک پلیمراز Taq ممکن می-سازد. 
DNA الگوی دو رشته ای با حرارت دادن به دمای بالاتر از ذوب آن (98 درجه سانتیگراد) دناتوره می شود و رشته های DNA جدا می شوند. دما کاهش می یابد تا امکان بازپخت پرایمر به DNA الگو فراهم شود. DNA پلیمراز Taq، پرایمر را در صورتی که به رشته الگوی هدف DNA متصل شده باشد، با افزودن نوکلئوتیدهای مکمل مناسب به سه انتهای اصلی [3'] آغازگر متصل گسترش می‌دهد. غلظت بالای پرایمر تضمین می کند که بازپخت و گسترش پرایمر نسبت به بازپخت مجدد رشته الگو ترجیح داده می شود. واکنش با افزایش دما متوقف می شود و دناتوره شدن رشته رخ می دهد. سپس دما کاهش می یابد تا امکان بازپخت پرایمر فراهم شود و چرخه تکرار می شود. واکنش PCR به صورت نموداری نشان داده می شود.
پس از سه چرخه اول، اکثر رشته های DNA آنهایی هستند که توسط پرایمرها در هر دو انتها متصل می شوند. چرخه های تقویت بیشتر منجر به افزایش تصاعدی DNA تقویت شده می شود و بنابراین طول مشخصی خواهد داشت. واکنش به عنوان یک مخلوط واکنش حجمی 50 ul انجام می شود. این محصول بر روی ژل آگارز الکتروفورز می شود. در رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید و تجسم در نور UV، مولکول های DNA فلورسانس می شوند. اندازه گیری وزن مولکولی با مقایسه مهاجرت با نشانگرهایی با وزن مولکولی شناخته شده انجام می شود.

برخی از تغییرات مهم PCR عبارتند از:

Multiplex PCR در تکثیر همزمان بیش از یک مکان ژنتیکی، با استفاده از بیش از یک مجموعه پرایمر در همان واکنش انجام می‌شود. این می تواند برای افتراق بین عوامل ایجاد کننده ضایعه استفاده شود. بسته به وزن مولکولی قطعه تکثیر شده می توان عامل اتیولوژیک را تعیین کرد.

تایپ‌سازی تصادفی چند شکلی DNA (RAPD):

از این تکنیک برای شناسایی اپیدمیولوژیک ایزوله‌های باکتریایی استفاده می‌شود. یک یا چند آغازگر کوتاه با طول متغیر به طور دلخواه انتخاب می‌شوند و اجازه داده می‌شود تا به راحتی DNA الگو را بازسازی کنند. تکثیر PCR انجام می شود و محصولات با الکتروفورز حل می شوند تا اثر انگشت DNA بدست آید که با توجه به میزان ارتباط سویه های مورد بررسی متفاوت است.

رونوشت معکوس (RT) PCR:

این تکنیک از RNA به عنوان یک الگوی شروع استفاده می کند. RNA توسط یک رونوشت معکوس رتروویروسی به cDNA تبدیل می شود. cDNA تقویت می شود و باند تقویت شده شناسایی می شود. یک شکل اصلاح شده نوترکیب از ژن Thermus thermophilius DNA پلیمراز بیان شده در E.coli، آنزیم rTth، دارای فعالیت رونویسی معکوس کارآمد در حضور منگنز و فعالیت DNA پلیمراز در حضور منیزیم است. استفاده از این آنزیم تعیین بیان mRNA سلولی را با روش تک مرحله ای امکان پذیر کرده است. اهمیت RT PCR در توانایی آن در تشخیص ویروس های RNA (مانند HIV)، مطالعه سیگنال های داخل سلولی (مانند بیان اینترلوکین درون سلولی) و درمانی برای تعیین کمیت بارهای ویروسی (مانند RT PCR نیمه کمی برای بارهای HIV برای نظارت بر پاسخ به درمان ضد رتروویروسی) نهفته است. 

تقویت مبتنی بر توالی اسیدنوکلئیک (NASBA):

این یک روش مبتکرانه است که همدما بوده و نیازی به چرخه حرارتی ندارد. RNA به cDNA تبدیل می شود که حامل یک توالی RNA پلیمراز T7 در یک انتها در مرحله شروع است و RNA چسبنده توسط RNase H حذف می شود. رونوشت معکوس (RT) سپس یک مولکول DNA مکمل را برای به دست آوردن ساختار دو رشته ای سنتز می کند. سپس RNA پلیمراز T7 تعداد زیادی کپی RNA را سنتز می کند. چرخه برای تولید RNA آنتی سنس به عنوان محصول نهایی تقویت شده تکرار می شود.

واکنش زنجیره ای لیگاز (LCR):

در این روش از چهار آغازگر استفاده می شود. این آغازگر ها با طراحی ویژه خود در اثر حرارت دیدن، پرایمرها به گونه ای متصل می شوند که بلافاصله در مجاورت یکدیگر قرار گیرند و توالی هدف را کاملاً بپوشانند. DNA لیگاز موجود به هر دو قطعه می‌پیوندد که می‌توان آن‌ها را شناسایی کرد.

کاربردهای PCR در تشخیص بیماری های عفونی:

تشخیص بیماری سل:

با افزایش بروز عفونت HIV و سویه های مقاوم به چند داروی M tuberculosis، تشخیص زودهنگام برای تشخیص و درمان حیاتی است. تکنیک‌های کلاسیک برای تشخیص عفونت دارای یک اشکال هستند که ارگانیسم سریع است و به کندی رشد می‌کند. بسیاری از استراتژی های مولکولی برای تشخیص مایکوباکتری ها توسعه یافته اند. موارد مهم عبارتند از PCR، تقویت با واسطه رونویسی، تقویت مبتنی بر توالی اسیدنوکلئیک و واکنش زنجیره ای لیگاز. گونه‌زایی مایکوباکتریایی که با تکنیک‌های مرسوم زمان‌بر و سخت‌گیر است، می‌تواند به راحتی با Multiplex PCR تمایز یابد. آزمایش حساسیت مولکولی برای داروهای خط اول INH و ریفامپیسین بر اساس این واقعیت است که یک جهش در ژن cat و ژن rpoB وجود دارد. این را می توان با یک تکثیر PCR قطعه ژن و به دنبال آن یک الکتروفورز ساده در ژل های دناتوره کننده برای تجزیه و تحلیل پلی مورفیسم ساختاری تک رشته ای (SSCP) تشخیص داد. این تکنیک حساس است و قادر به تشخیص جهش های حتی نقطه ای است، روش های فوق منجر به تشخیص زودهنگام عفونت های سل و شروع درمان مناسب می شود.

فارنژیت استرپتوکوکی:

در کشورهای توسعه یافته تشخیص PCR استرپتوکوک های همولیتیک Gp A توسط PCR (تست مستقیم استرپتوکوک Gp A یا GASD) اهمیت بیشتری پیدا می کند زیرا حذف قطعی آن می تواند درمان تجربی فارنژیت، محدود کردن استفاده از آنتی بیوتیک های بتالاکتام و کاهش هزینه های کلی را کاهش دهد. 

درمان پنومونی آتیپیک:

یک استراتژی مبتنی بر PCR مالتی پلکس که در آن تشخیص سریع عفونت‌های ناشی از Chlymydia pneumoniae، Mycoplasma pneumonia و legionellae می‌تواند به تغییر شکل مدیریت پنومونی غیر معمول کمک کند.

بیماری مزمن:

عفونت های مداوم توسط HSV، CMV، EBV، VZV، ویروس HHV، JC، سرخک، هپاتیت، که ندرت وارد اندام نمی شوند و تشخیص و درمان دشواری دارند. در ميزبان داراي توان ايمني، اين بيماري ها معمولاً به صورت يك بيماري حاد ظاهر مي شوند و بهبودي با يك ايمني محافظ قوي به دنبال دارد. با این حال در میزبان نقص ایمنی این عفونت ها ممکن است دوباره فعال شوند. آنها نه تنها یک معضل تشخیصی ایجاد می کنند، بلکه تشخیص نوکلئیک اسید آنها با روش های تقویتی ممکن است ارتباط بالینی نداشته باشد. سنجش های کمی برای حضور آنها مهم است و توسعه یافته است.
بیماری های تب دار حاد مانند مالاریا فالسیپاروم، سالمونلوز، بابزیوز با استفاده از PCR شناسایی شده اند. به خصوص در مورد عفونت فالسیپاروم استفاده از یک واکنش PCR و سنجش هیبریدیزاسیون با پروب های مختلف در شناسایی گونه ها استفاده می شود.

نتیجه گیری:

ظهور تکنیک های تشخیص نوکلئیک اسید در میکروبیولوژی پزشکی، انقلابی در تشخیص و پیش آگهی بیماری ایجاد کرده است. اکنون می توان ارگانیسم های دشوار را با حساسیت و دقت بیشتری شناسایی کرد. پایش مقاومت دارویی مایکوباکتری ها با استفاده از روش های مبتنی بر اسید نوکلئیک، تکنیک مهمی را برای نشانگرهای اولیه مقاومت دارویی فراهم می کند که امکان شروع درمان مناسب اولیه را فراهم می کند. بنابراین PCR یک ابزار ارزشمند در تشخیص بیماری است. ادغام آزمایشات مبتنی بر اسید نوکلئیک در خدمات آزمایشگاهی زمان چالش برانگیز و هیجان انگیزی را برای میکروبیولوژیست بالینی به همراه خواهد داشت.